pwodiksyon mononukleotid β-nikotinamid (NMN) nan Escherichia coli

Abstract

Dyabèt se yon maladi kwonik ak pwogresis ak kontinyèl ogmante prévalence, k ap monte presyon finansye sou sistèm swen sante yo atravè lemond. Dènyèman, yo te rezistans ensilin, Hallmark nan kalite 2 dyabèt, geri nan sourit trete yo ak NAD ⁺ précurseur β-nikotinamid mononukleotid (NMN) , pa gen okenn efè toksik ke yo te rapòte. Sepandan, NMN gen yon tag pri segondè, plis metòd pwodiksyon pri efikas yo bezwen. Etid sa a pwopoze yon metòd pwodiksyon bioteknoloji NMN nan Escherichia coli . Nou montre ke ekspresyon bicistronik nan recombinant nicotinamide fosforibozil transfòmasyon (Nampt) ak fosfibozil pirofosfat (PRPP) sentetaz nan prezans nicotinamide (NAM) ak laktoz ka yon estrateji siksè pou pwodiksyon pri NMN efikas. Vektè ekspresyon pwoteyin pote jèn NAMPT soti nan Haemophilus ducreyi ak PRPP sentetaz soti nan Bacillus amyloliquefaciens ak L135I mitasyon yo te transfòme nan Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS. Pwodiksyon NMN rive nan yon maksimòm de 15.42 mg pou chak L nan kilti bakteri (oswa 17.26 mg pou chak gram pwoteyin) nan selil sa yo grandi nan medyòm PYA8 ki te konplete avèk 0.1% NAM ak 1% laktoz.

Entwodiksyon

Dapre Entènasyonal Federasyon Dyabèt, ki kantite granmoun ki gen dyabèt tip 2 te 425 milyon dola nan 2017, epi li espere frape 649 milyon dola pa 2045. Sou yon echèl mondyal, 12% nan bidjè a swen sante (oswa $ 727 milya dola) ap depanse. sou trete dyabèt. Dènye etid lye rezistans ensilin, Hallmark nan kalite 2 dyabèt, nan n bès nan mitokondriyo fonksyon ak diminye NAD ⁺ nivo kòm byen ke NAD ⁺ / rapò NADH, tou obsève nan aje. NAD ⁺ prezan nan tout òganis vivan e se yon kenz byen koni nan reyaksyon oksidasyon-rediksyon. NAD ⁺ -dependans deacetylases pwoteyin tankou SIRT1 ak SIRT6 sèvi kòm detèktè metabolik, ak kontwole wout en, ki evantyèlman retabli fonksyon mitokondriyo ak sansiblite ensilin. Konklizyon sa a pwolonje domèn rechèch efè NAD ⁺ sou lòt maladi dejeneratif ki asosye avèk aje, tankou: kadyovaskilè, kansè, atrit, osteyopowoz oswa maladi alzayme.

Mononukleotid β-nikotinamid la (NMN) se yon entèmedyè nan NAD ⁺ biosentèz ki pwodui nan nikotinamid (NAM) ak pirofosfat fosforibozil (PRPP) pa anzim nicotinamide fosforibozil transferaz (Nampt) (EC 2.4.2.12). Yo te byen tolere, ki pa gen okenn efè segondè rapòte pandan administrasyon tèm long nan sourit yo, ak anpeche laj-asosye n bès fizyolojik, NMN te pwouve yo dwe efikas nan trete grès rejim alimantè ki wo dyare ki te pwovoke dyabèt 2, pa ranvèse malfonksyònman mitokondriyo ki asosye ak aje, ak sovtaj efè bès laj ki asosye nan selil soust nè yo.

NAM se anjeneral konvèti nan NMN pa anzim ki enplike nan NAD ⁺ wout yo sovtaj, tankou Nampt. Aksyon an nan anzim sa a konstitye prensipal aktivite NAD ⁺ anabolizan nan selil la. Règleman an nan mamifè oswa mikwo-òganis metabolism nikleyotid ak biosentèz anjeneral montan pa konsomasyon nan PRPP. PRPP rezilta soti nan ribose-5-fosfat atravè tou de branch oksidatif ak sa ki pa oksidatif nan pentose fosfat chemen.

Nan bakteri, NAM pi souvan konvèti nan asid nicotinic (NA) pa nicotinamidase, ki se entegre nan chemen Preiss-Handler, sa a yo te tou ka a nan Escherichia kol . Nan mamifè yo, aktivite nicotinamidase pa te rapòte; NAM konvèti nan NMN pa youn nan anzim yo transfere fosforibozil NAM olye. Malgre ke pifò nan bakteri manke NAM fosforibozil transfèz, se anzim a eksprime nan Haemophilus ducreyi ak Shewanella oneidensis .

Senp ak metabolisman versatile òganis, tankou Escherichia coli , yo itilize souvan nan biotechnologie pou ekspresyon kontwole nan pwoteyin ak aktivite vle anzimatik. ADN kodaj pou anzim sa yo souvan prezante nan bakteri pa vektè ekspresyon tankou sistèm pET soti nan Novagen. Pèk vektè yo transfòme nan bakteri eksprime T7 RNA polymerase, tankou E. coli BL21 (DE3). Se kontwòl nan ekspresyon anzim reyalize lè l sèvi avèk pwomotè lac , ki vire sou ekspresyon an sèlman nan prezans laktoz (tou metabolize kòm yon sous kabòn) oswa li yo sentetik sentòm estriktirèl, Isopropyl-1-Thio-β-D-galactopyranoside (IPTG) ( pa metabolize, ak konsantrasyon konstan pandan pwosesis k ap grandi). Kòm metabolis bakteri se versatile, varyasyon nan sous kabòn ak konsantrasyon mwayen substrats anzin siplemantè yo se faktè kle yo pran an konsiderasyon nan yon pwosesis biotechnologie.

Vize adrese pwoblèm aktyèl la pri NMN , nan travay anvan nou an, nou pwopoze yon metòd pou pirifye soti nan selil bakteri. Pou plis pwosesis optimize, menm jan nou te kapab jwenn yon sèl metòd pwodiksyon levi pibliye, etid sa a pwopoze yon senp ak pri efikas metòd pwodiksyon bioteknoloji NMN nan Escherichia coli .

Rezilta yo

Transfòmasyon bakteri

Plizyè sekans amine asid aliyman an pwodwi pou NadV putatif soti nan Haemophilus ducreyi , NadV, Shewanella oneidensis MR-1 ak Nampt soti nan Mus muskul , montre gwo resanblans (Fig. S1), fè tout bagay sa yo anzim kandida pou yon pwosesis biotechnologie.

Transfòme E. selil coli ak jèn nadV (NAMPT) ki te pote pa pET28a (+) plasmid yo te fòme koloni sou plak yo Agar LB complétée ak kanamycin. Pa gen koloni yo te detekte sou plak inokule ak selil ki pa transfòme bakteri. Elektwoforèz agaroz jèl ADN plasmid izole nan koloni sa yo konfime prezans plasmid Nampt-PET28a, pET28a-soNadV oswa pET28a-hdNadV nan E. coli DH5α (Siplemantè Fig. S2A, liy 2, 3, 4). Gwoup yo ADN matche Gwoup Mizik yo soti nan E. coli BL21 (DE3) selil pLysS (Siplemantè Fig. S2A, liy 6, 7, 8), ki te transfòme avèk plasmid korespondan ki sòti dirèkteman nan E. coli DH5α. Nan untransformed E. coli BL21 (DE3) selil pLysS, itilize kòm kontwòl negatif, yo te prezans nan pLysS plasmid la konfime pa elèktroforèz, yon bann matche longè a li te ye nan 4886 bp (Siplemantè Fig. S2A, liy 5) yo te montre sou jig.

(Pou plis done eksperimantal, gade sou sit wèb orijinal la: https://www.nature.com/articles/s41598-018-30792-0#Sec14)